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    公开号:WO1989011099A1
    申请号:PCT/JP1989/000455
    申请日:1989-05-01
    公开日:1989-11-16
    发明作者:Sadao Kimura；Masashi Yanagisawa；Yoshio Yazaki；Hiroki Kurihara；Masaru Hamaoki；Hirohisa Kato
    申请人:Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 抗エン ドセ リ ン抗体 技 術 分 野
    [0002] 本発明は、 エン ドセ リ ン （Endothelin) に対して特異 的に反応する抗体、 該抗体の製造法、 該抗体を使用 した ェン ドセ リ ンの免疫学的測定法およびェン ドセ リ ンの免 疫学的測定用キッ 卜 に関するものである。
    [0003] 背 景 技 術
    [0004] ェン ドセ リ ンは血管内皮細胞よ り分泌される血管収縮 活性を有する新規な生理活性ペプチ ドであ り （Nature, Vol . 3 3 2 , p 4 1 1 〜 4 1 5 ( 1 9 8 8 ) 参照） 、 該生理活性ペプチ ド、 その加水分解フ ラ グメ ン ト または 該ペプチ ドの前駆体の血中濃度を測定する こ と は本態性 高血圧症のメ カ ニズムを解明するためにも有意義な こ と と考えられている。
    [0005] 従来、 ホルモン等の生理活性ペプチ ドの濃度を測定す る一手段と しての免疫学的測定法が種々開発されている 〔内分泌実験講座第 5卷 「ホルモン測定法（上）」、 同講 座第 6卷 「ホルモ ン測定法 （下） 」 （以上、 1 9 8 2年 5 月 2 0 日㈱講談社発行）など参照〕 。 しかし、 エン ド セ リ ンの場合にはェン ドセ リ ンに対して特異的に反応す る抗体が調製されておらず、 このためエン ドセ リ ンを免 疫学的測定法によ り測定することは不可能なこ とであつ た。
    [0006] したがって、 本発明は、 エン ドセ リ ンに対して特異的 に反応する抗体を取得するこ とを第 1 の目的と し、 次に 取得した抗体を用いてエン ドセ リ ンを兔疫学的に測定す る方法の確立を第 2の目的とするものである。
    [0007] 発 明 の 開 示
    [0008] 本発明者らは、 ェン ドセリ ンに対して-特異的に反応す る抗体を取得すべく研究を重ねた結果、 該抗体の取得に 成功する とともに、 取得した抗体を用いる こ と によ リエ ン ドセ リ ンを測定することができる こと を知見し、 本発 明を完成させた。
    [0009] すなわち、 本発明はエン ドセ リ ンにま ίして特異的に反 応する抗体 （以下、 本発明抗体と称する こ ともある） を 提供するものである。
    [0010] また、 本発明はェン ドセ リ ンに ¾·して特異的に反応す る抗体の製造法を提供するものである。
    [0011] また、 本発明はエン ドセリ ンに対して特異的に反応す る抗体を使用 したエン ドセリ ンの兔疫学的測定法を提供 するものである。
    [0012] さ らに、 本発明はエン ドセ リ ンを免疫学的に測定する ためのキッ ト を提供するものである。
    [0013] 図 面 の 箇 単 な 説 明 漦工〜 3 図は抗血清の希釈率とその吸光度の関係を示 したものである。 第 1 図は、 ヒ ト由来のエン ドセ リ ンと ゥシ血清アルブミ ン と の複合体を抗原と して使用 し、 こ れをマ ウスに免疫して得られた抗血清を使用 して作成し たものである。 第 2 図は、 ヒ ト由来のエン ドセ リ ンとェ ッ グアルブミ ン と の複合体を抗原と して使用 し、 これを ゥサギに免疫して得られた抗血清を使用 して作成したも のである。 第 3 図は、 後述の合成ペプチ ドと ゥシ血清ァ ルブミ ンと の複合体を抗原と して使用 し、 これをマ ウス に免疫して得られた抗血清を使用 して作成したものであ る。
    [0014] 第 4 図は本発明の抗ェン ドセ リ ンモノ ク ローナル抗体 のエン ドセ リ ンに対する中和作用を示したものである。 第 4 ( a ) 図は本発明のモ ノ ク ロ ーナル抗体を投与して ないと きの結果を示したもので、 第 4 ( b ) 図は本発明 のモ ノ ク ローナル抗体を投与したと きの結架を示したも のである。
    [0015] 第 5 〜 7 図は本発明の抗エン ドセ リ ンモ ノ ク ロ ーナル 抗体を使用 して作成した検量線である。 図中、 黒丸 （き） はヒ ト由来のエン ドセ リ ンの溶解溶液を抗原溶液と して 使用 した時の測定値、 白丸 （〇） は後述の合成ペプチ ド の溶解溶液を抗原溶液と して使用 した時の測定値をそれ ぞれ示したものであ り 、 黒丸および白丸に付記した上下 の線は同様の測定を 5 回行っ た時の標準偏差を表わす。 なお、 第 5 図は第 1 7ハイ プリ ドーマ株産生のエン ドセ リ ンの C末以外のと ころと特異的に反応するモノ ク ロー ナル抗体を使用して作成したものであ り、 第 6 図は第 1 6ハイブリ ドーマ株および第 7 図は第 2 0ハイブリ ド —マ株がそれぞれ産生するエン ドセ リ ンの C末部分と特 異的に反応するモ ノ ク ローナル抗体を使用 して作成した ものである。
    [0016] 第 8 図は第 1ハイプリ ドーマ株と第 5ハイプリ ドーマ 棟の産生する 2種類のモノク ローナル抗体を使 するサ ン ドィ ツチ法によ り作成した検量線である。
    [0017] 発 明 を 実 施 す る た め の 最 良 の 形 態
    [0018] 以下、 本発明を詳細に説明する。
    [0019] I . 抗原の調製
    [0020] 本発明抗体を調製するために使用する抗原と しては、 ヒ 卜、 サ Jレ、 ブタ、 ゥシ、 ャギ、 ゥサギ、 モ Jレモッ 卜、 ラ ッ ト、 マウスなどの哺乳動物よ り調製したエン ドセ リ ン、 該エン ドセ リ ンを加水分解して得られる フ ラ グメ ン ト、 または該エン ドセリ ンと同一の抗原決定基を 1種も しく は 2種以上有する合成ペプチドなどを例示する こ と ができる。
    [0021] 哺轧動物よ リ調製したェン ドセ リ ンの具体例と しては、 たとえば下記式 〔 I 〕 のア ミ ノ酸配列からなる ヒ トまた はブタ由来のエン ドセ リ ンを例示することができる （た だし、 ヒ ト由来のエン ドセ リ ンとブタ 由来のものは同一 の構造を有している） 。 Glu— Lys— Asp— Met—し eu— Ser— Ser— Cys— Ser— Cys— NH:
    [0022] Cy s-
    [0023] Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-CooH
    [0024] C I )
    [0025] 〔式中、 Cysは L — システィ ン、 Serは L ー セ リ ン、 Leu は L 一 口 イ シン、 Metは L 一メチ才ニン、 Aspは L ー ァス パラ ギン酸、 Lysは L — リ ジン、 Gluは L 一 グルタ ミ ン酸 Valは L ーノ リ ン、 Tyrは L ーチロ シン、 Pheは L 一 フエ 二ルァ ラ ニ ン、 Hisは L 一 ヒ スチジン、 lieは L 一 イ ソ 口 イ シ ン、 Trpは L 一 ト リ プ 卜 フ ァ ン を示す。 〕
    [0026] ニ ン ドセ リ ン を加水分解 して得られる フ ラ グメ ン ト と しては、 たと えば、 上記の ヒ ト またはブタ 由来のエ ン ド セ リ ン をア ミ ノぺプチダーゼ、 カルボキシぺプチダ一ゼ な どのェキソぺプチダ一ゼを用いて N末端側およぴノま たは C末端側から順次切断 して得られる フ ラ グメ ン 卜、 セ リ ンプロテアーゼ、 チオールプロテアーゼ、 カルボキ シルプロテアーゼ、 メ タノレプロテア一ゼな どのェン ドぺ プチダーゼによ り切断して得られる フ ラ グメ ン トな どの 各種酵素の加水分解フ ラ グメ ン ト を例示する こ と がで き る。
    [0027] また、 合成ペプチ ド と しては、 たと えば上記の ヒ ト ま たはブタ 由来のエン ドセ リ ンのア ミ ノ酸配列において 3 個以上、 好ま し く は 6個以上のア ミ ノ酸から な る任意の 箇所のア ミ ノ酸配列と 同一のア ミ ノ酸配列を 1 種も し く は 2種以上含有する合成ペプチ ドを例示する こ と ができ る。
    [0028] このよう なエン ドセ リ ン、 その加水分解フ ラ グメ ン ト およびェン ドセリ ン中に存在する抗原決定基と同一の抗 原決定基を 1種も し く は 2種以上有する合成ペプチド
    [0029] (以下、 これら を単に 「エン ドセ リ ン抗原 J と称する） は、 血管内皮細胞の培養液から单離する方法、 化学的に 合成する方法などの常法から使甩するエン ドセ リ ン抗原 の種類に応じた最良の調製法を適宜選択して調製すれば よい。
    [0030] 血管内皮細胞の培養液からェン ドセリ ン抗原を単離す る方法と しては、 たとえばブタなどの哺乳動物の大動脈 よ り擦過法によ り得た内皮細胞の培養上清をイ オ ン交換 クロマ グラ フィ ーおよぴ逆相ク ロマ トグラフィ ーなど のペプチドの通常の单離精製手段を適宜組み合わせて処 理する こ と によ りエン ドセリ ン抗原を単離精製する こ と ができ る （詳細は、 Nature. Vol . 3 3 2、 4 1 1 〜 4 1 5 ( 3 1 . March. 1 9 8 8 ) 、 実験医学、 第 6巻 (第 4号） 、 第 1 1〜 1 6頁 （ 1 9 8 8 ) 参照） 。
    [0031] また、 エン ドセ リ ン抗原を化学的に合成する方法と し ては、 アジド法、 酸ク ロ リ ド法、 非ま ί称型酸無水物法 (混合酸無水物法、 リ ン酸， ヒ酸無水物法など） 、 对称 型酸無水物法 （ Ν， Ν ' —ジシク ロへキシルカルボジィ ミ ド （ D C C ) 法など） 、 活性エステル法 （ ρ —二小口 フ エ 二ノレエステル法、 N—ヒ ド ロ キシコノヽク酸イ ミ ドエ ステル法、 シァ ノ メチルエステル法な ど） 、 ウ ッ ド ヮー ド試薬 Kを用いる方法、 カルボニルジイ ミ ダゾ一ル法、 酸化還元法、 D C C Zアディ ティ ブ （例、 H 0 N B、 H 〇 Β Τ、 Η 0 S u ) 法など通常用い られている方法を適 宜選択して実施すればよい。 また、 これ らの化学的合成 法は液相法、 固相法のいずれであってもよ く 、 また、 合 成手順と してア ミ ノ酸を 1偭づっ縮合させてい く段階的 伸長法、 数倆のア ミ ノ酸からなる フラグメ ン ト を綰合さ せてい く フラグメ ン ト縮合法のいずれの方法も適用する こ と ができる。 なお、 これらの合成法の具体的な手順、 手法に闋しては成書を参照する こ と ができる 〔 「 The Peptides」 Vol, 1、 Academic Press , ! e York ,
    [0032] U S A ( 1 9 6 6 )、 「ペプチ ド合成」 （丸善株式会社、 1 9 7 5年） 〕 。
    [0033] このよ う に して得られたエン ドセ リ ン抗原は、 分子 が小さ く 、 抗原性が低いため、 適当な高分子量担体に結 合または吸着させた複合体を免疫抗原と して使用する。
    [0034] ェン ドセ リ ン抗原を結合させるための高分子量の担体 と しては、 通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあた リ常用されている天然も し く は合成の担体を使用する こ と ができる。 天然の高分子担体と しては、 たと えば、 ゥ シ血清アルブミ ン、 ゥサギ血清アルブミ ン、 ヒ ト血清ァ ルブミ ンな どの動物血清アルブミ ン類、 ゥ シ血清グロ ブ リ ン、 ゥサギ血清グロ ブリ ン、 ヒ ト血清グロブリ ン、 ヒ ッジ血清グロ プリ ンな どの動物血清グロプリ ン類、 ゥシ チログロブリ ン、 ゥサギチログロブリ ンなどの動物チロ グロブリ ン頮、 ゥシへモグロ ビン、 ヒッジヘモグロ ビン、 ヒ トヘモグロ ビンなどの動物ヘモグロ ビン類、 キ一ホー レリ ンぺッ 卜へモシァニンなどのへモシァニン類などを 例示する こ とができ る。 合成の高分子担体と しては、 た とえば、 ポリ リ ジン、 ポリ グルタ ミ ン酸、 リ ジン一グル タ ミ ン酸共重合物などのア ミ ノ酸の重合物または共重合 物、 スチ レ ン、 ク ロソレスチ レ ン、 α —メ チノレスチ レ ン、 ジビニゾレベンゼン、 スチレンスルホン酸ナ ト リ ゥム、
    [0035] (メタ） アク リル酸、 （メ タ） アク リル酸ェチノレ、 （メ タ ） ァ ク リ ノレニ ト リ ノレ、 （メ タ ） ァ ク ロ レイ ン、 （メ タ ） アク リルア ミ ド、 ブタ ジエン、 イ ソプ レ ン、 酢酸ビニル、 ビニルビリ ジン、 Ν— ビニルピロ リ ドン、 塩化ビニル、 塩化ビニ リ デンなどの芳香族ビニル化合钩、 a , iS —不 鉋和カルボン酸またはそのエステル類、 ct ， —不飽和 二 ト リル化合物、 ハロゲン化ビニル化合物、 共役ジェン 化合物などから調製した重合物または共重合物などの各 種ラテッ クスなどを例示する こ と ができる。
    [0036] このよう な担体とエン ドセ リ ン抗原と の結合は、 物理 的吸着法、 共有結合法、 イオン結合法などいずれの結合 法を採用 しても よい。
    [0037] 物理的吸着法の具体例と しては、 たと えばポリ ビニル ピロ リ ドンまたはラテ ッ ク ス粒子とエン ドセ リ ン抗原を 室温で 1〜 3 時間ゆつ く り撹拌する こ と によ リ実施する こ と ができ る（詳細は、 Endocrinology， 9 3、 1 0 9 2 ( 1 9 7 3 )、 特開昭 6 1 — 4 3 1 2 4号公報など参照） 。 また共有結合法は、 エ ン ドセ リ ン抗原および担体中に存 在しているア ミ ノ基、 カルボキシル基、 スルフイ ド リ ル 基：な ど:'の,各. 官能墓を活性化 してエ ン ドセ リ ン抗原と担 体と を結合する こ と のでき る結合剤の存在下、 ホ ウ酸緩 衝液、 リ ン酸緩衝液などの各種緩銜液中、 高分子担体 1 モルに封してエン ドセ リ ン抗原 1〜 5 0倍モルおよび過 剰量の結合試薬を使用 して、 反応温度 0〜 5 0 °Cで 3 0 分〜 3 0 時間反応させる こ と によ リ実施する こ と ができ る。
    [0038] エ ン ドセ リ ン抗原と担体と の結合に使用する結合剤と しては、 ハプテ ンまたはペプチ ド と担体または酵素と の 結合の際に常用されているものであればよ い。 た と えば、 チロ シ ン、 ヒ スチジン、 ト リ プ ト フ ァ ン中の複素環を架 橋する ビスジァゾ化ベンチジン、 ビスジァゾ化 3 ， 3 ' ー ジァニシジンな どの ビスジァゾニ ゥム化合物、 ア ミ ノ 基同志を架橋させる グ リ オ キサール、 マ ロ ンジアルデヒ ド、 グノレタ ーノレアノレデヒ ド、 スク シンアルデヒ ド、 ァジ ポアルデヒ ドな どのジアルデヒ ド化合物、 ト ルエ ン一 2 ，
    [0039] 4 ー ジイ ソ シァネ一 卜 、 キ シ レ ン ジイ ソ シ ァネ ー ト な ど のジイ ソシァネー ト化合物、 2， 4 ー ジニ ト ロ一 1 ， 5 一ジフゾレオ口べンゼン、 p， p ' ージフノレオロー m， m ' 一ジニ 卜 口 フエニノレス レホンなどのノ、ロニ 卜 口ベン ゼン化合物、 ジェチルマ ロンイ ミ デー トな どのイ ミ ドエ ステル化合物、 チオール基同志を架橋させる N， r 一 O—フエ 二 レンジマ レイ ミ ド、 N， N ' 一 m—フエニ レ ンジマ レイ ミ ドなどのジマ レイ ミ ド化合物、 ア ミ ノ基と チオ一ル基を架橋させる N— （m—マ レイ ミ ドベンゾィ ル Tキシ） ースク シンイ ミ ド、 4一 （マ レイ ミ ドメチル） 安息香酸 N—ヒ ド ロ キシスク シンィ ミ ドエステル、 m— マ レイ ミ ドベンゾィルー Kー ヒ ドロ キシスク シンイ ミ ド エステメレ、 4一 （マ レイ ミ ドメチル） ーシク ロへキサン 一 1一カルボキシルー N ' — ヒ ド ロ キシスクシンィ ミ ド エステルなどのマ レイ ミ ドースクシンィ ミ ド化合物、 ァ ミ ノ墓と カルボキシル基を架橋する N， ' ージシク ロ へキシルカルボジイ ミ ド、 N—ェチルー r ' 一ジメチル ァ ミ ノ カソレボジイ ミ ド、 1 ーェチルー 3 —ジイ ソプロ ピ ルア ミ ノカゾレボジイ ミ ド、 1 -シク ロへキシルー 3 —
    [0040] ( 2 —モノレホ リ ニルー 4 ーェチル） カルボジイ ミ ドメチ ルー p— トルエンスルホネ一 トなどのカルボジィ ミ ド化 合物、 N—ェチルー 5 —フ エニルイ ソォキサゾリ ゥムー
    [0041] 3 r ースルホネ一 トなどのィ ソォキサゾリ ゥム塩化合物、 ェチ レク ロ ロホノレメー 卜、 イ ソブチメレク ロ ロホノレメ ー ト などのアルキルク 口 ロホルメー ト化合物を使用する こ と ができる。 これ らの結合剤は使用するェン ドセ リ ン抗原中の官能 基と担体中の官能基の種類に応じて適宜選択して使用す ればよい。 なお、 エン ドセ リ ン抗原中の官能基と しては、 たとえば、 前記式 〔 I 〕 で表おされる ヒ トまたはブタ 由 来のエン ドセ リ ンをエン ドセ リ ン抗原と して使用する場 合の結合部位と しては、 エン ドセ リ ン中のチロシン、 卜 リ プ ト フ ア ン、 ヒ スチジンの複素環、 ァスパラ ギン酸、 グルタ ミ ン酸および C末端部のカルボキシル基、 N末端 部またはリ ジンのア ミ ノ墓、 システィ ンのチオール基な どを例示する こ と ができる。
    [0042] のよ う に して調製した免疫抗原 （エン ドセ リ ン抗原 と担体との複合体） は、 透析法、 ゲル瀘過法などの常法 に従って単離精製する こ と ができる。
    [0043] 上述のよ う に して調製した免疫抗原の う ち担体 1 モル 当 り 、 2 〜 2 0倍モルのエン ドセ リ ン抗原が結合したも のは、 エン ドセ リ ンに対して特異的に反応する抗体の製 造に特に有用なものである。
    [0044] π . 抗体の製造
    [0045] 上述の免疫抗原を用いて抗体を製造する場合には、 該 免疫抗原を動物に投与して生体内にエン ドセ リ ンに対し て特異的に反応する抗体を生産させ、 これを採取する と いう常法に従って実施する こ と ができる。
    [0046] すなわち、 免疫抗原を投与する動物と しては、 ゥシ、 ゥマ、 ヒ ッジ、 ラ ッ 卜、 マ ウス、 モノレモ ッ 卜、 ィ ヌ、 ブ タ、 ゥサギ、 サルなどの哺乳動物類、 ハ ト、 ニヮ ト リ な どの梟類を使用する ことができ、 特にマウス、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ゥサギが使用に好都合である。
    [0047] このような動物への兔疫抗原の投与は常法に徒って行 えばよ く、 たとえば、 完全フ ロ イ ン トアジュバン ド、 不 完全プ ロ イ ン トアジュ ノ ン ド、 ミ ヨ ウノヽ 'ンアジュ ノ、 'ン ド、 酸 ヒアルミニゥムアジュバン ド、 百日咳菌アジユ ンバ ン ドなどの各種アジュバン ドと上述の免疫抗原との懸濁 液を調製し、 これを上記動物の静脈、 腹腔内、 皮下また は皮内に注射すればよい。
    [0048] 投与量は、 動物と してゥサギ、 モルモッ トを使用する 場合には抗原量と して 0 . 0 1 〜 1 0 rag Z匹程度、 また マウス、 ラッ トを使用する場合には、 0 . 0 0 1 〜 l mg Z匹程度である。
    [0049] 初回投与後、 1 〜 4週間おきに 1 〜 5 回程度の上記と 同様の追加免疫を行い、 エン ドセ リ ン に対して特異的に 反応する抗体を得る ことができる。
    [0050] このよう に して得られた抗体は、 最終免疫の 1 〜 2週 間後に採血し、 これを遠心分離する こ と に よ り エ ン ドセ リ ンに対して特異的に反応する抗体を主成分と して含有 する抗血清と して取得する ことができる。 抗体の精製を 必要とする場合には、 また前記免疫抗原を固定化して得 た固定化抗原を利用 してエン ドセ リ ンとのみ特異的に反 応する抗体のみを分別精製したのち、 さ らに、 溶解度差 を利用 した選択的分別法 （たとえば、 塩析、 アルコ ール 沈殿など） ， 電荷の差を利用 した分別法 （たとえばィォ ン交換ク ロマ ト グラ フィ ー、 電気泳動など） 、 分子量の 差を利用 した分別法 （たとえば超遠心法、 ゲル濾過法な ど） などの常法を適宜組み合わせて抗血清中に存在する 抗体を抗体のク ラスごと に分別精製してもよい。
    [0051] 次:に、 エン ドセ リ ンに対して特異的に反応するモ ノ ク ローナル抗体の調 について説明すれば、 該モ ノ ク 口 一 ナル抗体は公知の細胞融合法、 E B ウィルスな どによ る ト ラ ンスフ ォーメ ーショ ン法などを適宜応用する こ と に よ り調製する こ と ができる。
    [0052] モ ノ ク ローナル抗体の大量生産によ り好適な細胞融合 法を例に挙げ説明すれば、 たとえば以下の手順でエン ド セ リ ンに対して特異的に反応するモ ノ ク ロ ーナル抗体を 取得する こ と ができ る。
    [0053] a ) 抗体産生細胞の調製
    [0054] 前記免疫抗原を前記と同様の動物に同様の条件で投与 し、 免疫を獲得した動物から抗体産生細胞 （脾細胞、 リ ンパ節細胞または末梢血細胞） を常法によ り取得する。 b ) ミ エコ一マ細胞の調製
    [0055] ミ エローマ細胞と しては、 マウス、 ラ ッ ト、 ゥサギ、 ヒ 卜などの種々の動物に由来し、 当業者が一般に入手可 能な株化細胞を使用する。 使用する細胞株と しては、 薬 剤抵抗性を有し、 未融合の状態では選択培地で生存でき ず、 抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質 を有するものが好ましい。 通常、 8 —ァザグァニン酎性 株が用い られ、 こ の細胞株はヒポキサンチン一ホスホリ ボシメレ 卜 つ ン ス フ ェ フ一セ (Hypoxanthine phospho- ribosyl transferase) を欠損し、 ヒポキサンチン * ァ ミ ノプリ ン · チミ ジン (H A T ) 培地に生育できない。 ま 細胞の性質と して免疫ク 口ブリ ンを分泌しない、 い おゆる.非分泌型の細胞株である ことが好ま しい。
    [0056] ミエローマ細胞株の具体例と しては、 P 3 X 6 3 Ag 8 (A T C C T I B — 9 ) (Nature , 2 5 6 ， 4 9 δ - 4 9 7 ( 1 9 7 5 ) ) 、 Ρ 3 X 6 3 Ag 8 U . 1 ( Ρ 3
    [0057] (A T C C C R L - 1 5 9 7 ) (Current
    [0058] Topics in Mecrofaiology and Immunology, 8 1 . 1 —
    [0059] 7- ( 1 9 7 8 ) ) 、 P 3 X 6 3 Ag 8 . 6 5 3 ( A T C C C R L - 1 5 8 0 ) (J.丄 mniunology， 1 2 3， 1 δ 4
    [0060] 8 - 1 5 5 0 ( 1 9 7 9 ) ) 、 P 3 Z S I i —Ag4 — 1 ( A T C C T I B — 1 8 ) (European J .
    [0061] I置 mimology， _6_, · 5 1 1 - 5 1 9 ( 1 9 7 6 ))、 S p 2 / O - Ag 1 4 (A T C C C R L - 1 5 8 1 ) (Nature , 2. 7 6 , 2 6 9 - 2 7 0 ( 1 9 7 8 ) ) などのマウス ミ エロ一マ細胞株、 2 1 0 . R C Y . Ag 1 . 2 . 3 ( Y 3 -Ag l . 2 . 3 ) (A T C C C R L - 1 6 3 1 ) ( Nature , 2 7 7 ， 1 3 1 - 1 3 3 ( 1 9 7 9 ) ) などの ラ ッ 卜 ミ ス口 一マ細胞株、 U— 2 6 6 — A Ri (Proc. Natl. Acad. Sci . U . S . A . , 7 7， 5 4 2 9 ( 1 9 8 0 ))、 G M 1 5 0 0 (Nature , 2 8 8 , 4 8 8 ( 1 9 8 0 )) 、 K R - 4 (Proc. atl. Acad. Sci . U . S . A .， 7 9， 6 6 5 1 ( 1 9 8 2 ) ) な どの ヒ ト ミ エ ロ ーマ鈿 胞株を例示する こ と ができ る 。
    [0062] c ) 細胞融合
    [0063] 細胞融合にあたっては、 抗体産生細胞に適合したミ エ ローマ細胞を選定する。 細胞融合は、 イーグル最少基本 培地 （ M E M ) 、 ダルべッ コ変法イ ーグル培地 （ D M i M) 、 R P M I 1 6 4 0培地などの動物細胞培養用培地 中で 1 07〜 1 08の ミ エローマ細胞と抗体産生細胞を混 合比 1 ： 4〜 1 0 に混合する こ と によ り行う こ と ができ る。 細胞融合を促進させるために、 平均分子量 1 0 0 0 〜 6 0 0 0 のポリ エチ レ ングリ コ 一ル （ P E G ) 、 ポ リ ビニールアルコール、 センダイ ゥ イノレスな どの融合促進 剤を使用する こ と ができ る。
    [0064] また、 電気パルスを利用 した市販の細胞融合装置を いて抗体産生細胞と ミ エローマ細胞を融合させる こ とも できる。
    [0065] d ) 選択培地におけるハイ プリ ドーマの選別
    [0066] 細胞融合処理後の細胞から 目的とするハイプリ ドーマ を選別する丰段と しては、 選択的培地における細胞の選 択的増殖を利用する方法を用いる こ と ができる。 たとえ ば、 細胞液を 1 5 % ゥ シ胎児血清 （ F C S ) 含有 R P M I 1 64 0培地などで道当に希釈後、 マイ ク ロプレー ト 上に 1 0 S〜 1 0SZゥエル程度まき、 各ゥエルに選択培 地 （たとえば、 H A T培地など） を加え、 以後適当に選 択培地を交橇して培養を行う 。 ミエローマ細胞と して 8 —ァザグァニン耐性株、 選択培地と して H A T培地を用 いた場合は、 未融合の ミエローマ細胞は培養 1 0 日 目 ぐ らいまでに死滅し、 正常細胞である抗体産生細胞もイ ン ビトロ (In vitro) では長期間成育できないので、 培養 1 0〜 1 4 日 目 から成育して く る細飽をハイブリ ドーマ と して得る ことができる。
    [0067] e ) エン ドセ リ ンに対して特異的に反応するモノ ク ロ一 ナル抗体を産生するハイブリ ドーマの検索
    [0068] エン ドセ リ ンに対して特異的に反応するモ ノ ク ローナ ル抗体を産生するハイプリ ドーマの検索は、 酵素標識免 疫定量法 （E L I S A) 、 放射性同位元紫免疫定量法
    [0069] ( R I A ) などによって行う ことができる。 たとえば、 エン ドセリ ン抗原を吸着させた 9 6 ゥエル E L I S A用 マイ ク ロプレー トにモノ ク ローナル抗体を含む培養上清 を添加して特異抗体を反応させ、 次いで結合した特異抗 体に酵秦標識抗免疫グロブリン抗体を反応させる力、、 ビ ォチン標識抗免疫グ口ブリ ン抗体およびァビジン D—酵 素標識体を反応させ、 各ゥエルに酵素基質を加えて発色 させる。 発色の有無によ リエン ドセリ ンと結合力を有す る抗体を産生するハイブリ ドーマの検索を行う ことがで き る。
    [0070] f ) ク ローニング
    [0071] ハイ ブリ ド一マのク ロ ーニングは、 限界希釈法、 軟寒 天法、 フイ ブリ ンゲル法、 蛍光励起セルソータ 一法な ど によ り行う こ と ができ る。
    [0072] g ) モ ノ ク ローナル抗体の生産
    [0073] このよ う に して取得 したノヽイ ブリ ドーマから抗ェン ド セ リ ンモ ノ ク ロ ーナル抗体を生産する方法と しては、 通 常の細胞培養法や腹水形成法な どが採用され う る 。
    [0074] 細胞培養法においては、 ノヽイ ブ リ ドーマ を 1 0 〜 ； L 5
    [0075] % F C S含有 R P M I 1 6 4 0培地、 無血清培地な どの 動物細胞培養用培地中で培養 し、 その培養上清液から抗 体を取得する こ どができ る。
    [0076] 腹水 ·から回収する方法では、 ハイ ブリ ド一マ と主要組 織適合性が一致する動物に、 プリ スタ ン （ 2 ， 6 , 1 0 ， 1 4 ーテ ト ラ メチルペンタ デカ ン） な どの鉱物油を腹腔 内に投与した後、 ハイ ブリ ド一マ を約 1 0 7個腹腔内投 与する。 ハイ プリ ドーマは 1 0 〜 1 8 日 ほどで腹水腫瘍 を形成し、 血清および腹水中に高濃度に抗体を生産する 。 抗体の精製が必要と される場合には、 硫安塩析法、 D
    [0077] E A E セルロ ースな どの陰イオン交換体を利用する ィ ォ ン交換ク ロマ ト グラ フィ ー、 プロテイ ン A—セ フ ァ ロ ー スなどを用いるァ フ ィ 二ティ —ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 分 子ふるいク ロマ ト グラ フィ 一な どの各種ク ロマ ト グラ フ ィ 一法など公知の方法を適宜に選択、 組合せる こ と によ リ精製する こ と ができる。
    [0078] ΠΙ 検体中のエン ドセ リ ンの免疫学測定法
    [0079] 本発明の測定法の特徴は、 本発明抗体またはその活性 フラグメ ン ト 〔たとえば、 F (ab' ) 2、 F ab'、 F a bなど〕 を抗体試薬と して使用する ところにあ り、 採用する免疫 学的測定のシステム自体には制限されない。 すなわち、 測定すべき抗原とそれに特異的に反応する抗体との結合 能を利用 して抗原—抗体反応を行わせ、 反応後の検体中 の抗原量に対応した抗体、 抗原または抗体一抗原複合体 の量を化学的または物理的手段によ り測定し、 既知量の 抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線から測定値 に ¾·応する抗原量を算出する方法であれば、 いずれの測 定法であっても本発明の測定法と して採 βする ことがで さる。
    [0080] このよ う な測定法と しては、 ネ フ ロ メ ト リ 一 （たと え ば凝集阻止反応を利用 した免疫比ろう法、 免疫比濁法な ど） 、 競合反応法 （たとえば液相法、 固相法など） 、 ィ ムノ メ ト リ ッ ク法、 サン ドイ ッチ法などを例示する こと ができる。 また、 測定システムで使用する標準物質と し ては、 .たとえば、 放射性同位元素 （たと えば 1 2 s I、
    [0081] 1 3 1 I 、 3 H、 1 4 Cなど） 、 酵素 （たとえば、 β—ガラク トシダーゼ、 ペルォキシダーゼ、 ァソレカ リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ、 グルコース一 6 —リ ン酸デヒ ドロゲナ一ゼなど） 、 補酵素 · 補欠分子族 （たとえば、 F A D、 F M N、 A T P、 ピオチン、 ヘムな ど） 、 蛍光色素 〔フルォ レセイ ン 誘導体 （たと えば、 フルォ レセイ ンイ ソチ才シアナー ト、 フルォ レセイ ンチオフルバ ミ ノレな ど） 、 ローダミ ン誘導 体 （たとえば、 テ トラメチノレローダミ ン B イ ソチォシァ ナー トな ど） 、 ゥムベ リ フエ ロ ン、 1 ーァニ リ ノ一 8 — ナフ タ レ ンスルホン酸など〕 、 ノレミ ノ 一ル誘導体 （た と えば、 ノレミ ノ 一ノレ、 イ ソル ミ ノ 一ノレ、 N— （ 6 — ァ ミ ノ へキシノレ） 一 ！^ —ェチルイ ソノレ ミ ノ ーノレな ど） 、 ニ ト ロ オキサイ ドラ ジカル （たと えば、 3 —置換一 2， 2 ， 5 ， 5 —テ ト ラ メチルピロ リ ジン一 1 —ォキシルな ど） 、 金 属錯体などを使用する こ と ができる。
    [0082] これら個々の兔疫学的測定法を本発明方法に応用する 場合、 特別の条件、 操作等の設定は必要と されない。 そ れぞれの方法における通常の条件、 手段に当業者の通常 の技術的配慮を加えて、 その方法の抗体試薬と して本発 明抗体またはその活性フ ラ グメ ン ト を使用 し、 測定目的 のェン ドセ リ ンを感度よ く 測定でき る よ う に測定システ ムを構成すればよい。 これらの一般的技術手段の詳細に ついては、 総説、 成書などを参照する こ と ができる 〔た とえば、 入江 寛編 「ラジオィ ム ノ ア ツ セィ」 （㈱講談 社、 昭和 4 9年 4 月 1 0 日発行） 、 入江 寬編 「続ラジ オイム ノアツセィ」 （㈱講談社、 昭和 5 4年 5 月 1 日発 行） 、. 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」（㈱医学書院、 1 9 7 8年 1 2月 1 5 日発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法』 （第 2版） （㈱医学謇院、 1 9 8 2年 1 2月 1 5 日発行） 、 臨床病理 臨時増刊 特集第 5 3号 「臨 床検査のためのィム ノアツセィ ー技術と応用一 J (臨床 病理刊行会、 1 9 8 3年発行） 、 Γ免疫測定法の新しい 活用事例と診靳試薬 * 治療開発への応用 -総合技術資料 集 iー丄 （経営教育出版、 昭和 6 0年 6月 2 0 日発行） 、 機合成化学、 第 3 8卷第 2号 （ 1 9 8 0 ) 、 第 1 5 1 〜 丄 6 3貝、 「Methods in EnzymoiogyJ Vol . 7 0 (0 Immunochemical Techniques (Part A ) ) 、 同書 ol .
    [0083] 7 3 (Immunochemical Techniques (Part B ) ) 、 同書 Vol . 7 4 (Immunochemical Techniques (PartC))、 同 書 Vol. 8 4 (Immunochemical "techniques (Part D ： Selected Immunoassay ) ) 、 同書 Vol, 9 2 (Immuno- 5 chemical Techniques (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods ). ) (以上、. ァカデ ミ、ッ クプレス社発行） など参照〕 。
    [0084] -- これらの免疫学的測定法のうち、 代表的な方法の測定 システムは次のとお り である。
    [0085] -0 ① 競合反応法
    [0086] 検体中の抗原と一定量の標識抗原と を抗俸にままして競 合反応させ、 未反応の抗原 （ F ) と抗体と結合した抗原 ( B ) とを分離し （ B Z F分離） 、 B および Fのいずれ かの標識量を測定し、 検体中の抗原量を定量する。 本反応法には抗体と して可溶性抗体を用い、 B Z F分 離をポリ エチ レ ングリ コール、 前記抗体に対する第二抗 体などを用いる液相法と抗体と して固相化抗体を用いる 力、、 第一抗体は可溶性のもの を用いて第二抗体と して固 相化抗体を用いる固相化法と がある。
    [0087] ② ィムノ メ ト リ ッ ク法
    [0088] 検体中の抗原と固相化抗原と を一定量の標識化抗体に 対して競合反応させた後固相と液相を分離する 力、、 ある いは検体中の抗原と過剰量の標識化抗体を反応させたの ち固相化抗原を加えて未反応の標識化抗体と反応させた 後固相と液相を分離し、 いずれかの相の標識量を測定し . 検体中の抗原量を定量する。
    [0089] ® サン ドィ ッチ法 i ,
    [0090] 試料中の抗原を固相化した第一抗体と反応させ、 さ ら に第一抗体の結合部位とは別の抗原の部位を認識する標 識化第二抗体を反応させ、 液相と固相と を分離し、 液相 または固相の標識量を測定し、 試料中の抗原量を定量す る。 この時、 第一抗体および第二抗体はポリ ク ローナル 抗体またはモ ノ ク ローナル抗体のいずれも使用でき、 ま た、 第一抗体と してポリ ク ロ一ナル抗体および第二抗体 と してモ ノ ク ローナル抗体を使用する組合せあるいはそ の逆の組合せであってもよい。
    [0091] 変法と して、 第二抗体に直接標識化せずに、 測定抗原 とは異なる抗原または結合子 （ビ才チンなどの化合物） を第二抗体に結合させたものを用い、 第二抗体と測定抗 原との反応終了後、 第二抗体に結合された抗原に対する 第三抗体または結合子に対する結合性物質 （アビシンな ど） の標識化物を反応させ、 液相と固相と を分離してい ずれかの標識量を測定する間接標識法もある。 結合子と 結合性物質の組み合おせと してビォチン一アビジン系が 広く .用: 、られている。
    [0092] w ェ- セ リ ン測定甩試薬キッ ト
    [0093] 本発明;の測定用試薬キッ トは、 キッ ト を構成する抗体 試薬と して本発明抗体またはその活性フラグメン ト を使 用する こと を特徴とする このため、 抗体および抗原試 薬の使用態様およびキッ トを構成する各試薬の選択など は、 採甩 した測定システムに適合するよう に適宜選択し 公知の方法を応用 して調製する こと ができる： 以下、 抗 钵および抗原試薬の使用態様と して繁用されている固相 化抗体 （抗原） および標識化抗佑 （抗原） の調製法につ いて説明する - Φ 匦相化抗体の調製
    [0094] 鍵;:体を担持させるための担俸の材質と しては、 多糖類 (たとえば、 セルロ ース、 デキス ト ラ ン、 デンプン、 デ キス ト リ ン、 ヒ ドロ キシェチ レセゾレロース、 p —ァ ミ ノ フエ ノ キシ ヒ ド ロ キシプロ ピノレデキス ト ラ ン、 ァガロー ス、 セフ ア デッ クスなど） のハロゲン化シアン活性化物
    [0095] (特公昭 4 5 — 3 8 5 4 3号公報参照） 、 多糖類のメ タ 過ヨ ウ素酸ナ ト リ ウム活性化物 （特開昭 5 8 — 7 5 6号 公報参照） 、 セルロースまたはその誘導体のア ミ ノエチ ルも し く はァ ミ ノ プロ ピル化物 （特開昭 5 9 — 4 2 4 5 2号公報参照） 、 セルロ ースまたはその誘導体のメルカ プ ト化物 （特開昭 5 8 — 8 0 5 5 8号公報参照） 、 多糖 類のシァネー ト化物 （特公昭 4 9 — 2 3 0 3 1号公報参 照） 、 多糖類のェピク ロルヒ ド リ ン一 P —ア ミ ノ フ エ ノ —ル処理物 （特開昭 5 4 — 1 5 8 9 9 4号公報参照） 、 芳香族ア ミ ノ基を含む多糖類誘導体のジァゾ化物 （希塩 酸、 亜硝酸ナ ト リ ウム処理） 、 セルロースカルボナー ト 誘導体、 酢酸セルロース、 天然繊維 （綿、 麻、 ウールな ど） な どの天然高分子誘導体担体、 エチ レ ン、 プロ ピレ ン、 塩化ビニル、 酢酸ビニル、 プロ ピオン酸ビニル、 ァ ク リル酸、 アク リル酸エステル、 メ タ ク リル酸、 メ タ ク リル酸エステル、 スチ レン、 メチルスチ レ ン、 ブタ ジェ ン、 イ ソプレ ン、 ァク リノレア ミ ド、 ァク リ ロ 二 ト リゾレ、 メ タ ク ロ 二 ト リルな どの重合体も し く は共重合体担体、 またはこれ ら に公知の手段によ り ア ミ ノ基、 ヒ ド αキシ ル基、 カルボキシル基、 スルホン基、 チォ一ル基、 アジ ド基、 イ ソシァ ノ基な どの反応性官能基を導入 したもの な どが挙げられる。
    [0096] 担体の形状と しては、 チューブ状、 テス トプ レー ト状、 ビーズ状、 ディ スク状、 球状、 スティ ッ ク状、 ラテ ッ ク ス状な どが例示でき る。 担体に固定化する抗体は、 抗体自体あるいは抗体の活 性フラグメン トである F (ab' ) 2、 F ab' も し く は F abで あってもよい。
    [0097] 固相化法と しては、 物理的吸着法、 共有結合法、 架橋 法、 包括法のいずれも適用する こ と ができる。 このよ う な固相化法の詳細については、 固定化酵素における方法 - 用: :す ばよ く、 たとえば千姻一郎編、 「固定化酵素 j
    [0098] (昭—和 5" 0年 3月 2 0 日、 橾式会社講談社発行） 第 9 〜 7 5頁などの成書や総説を参照すればよい。
    [0099] ② 固相化抗原の調製
    [0100] 抗原を担持させるための担体の材質および形状は上記 の固相化抗体の調製時に使用 したものと同じもの使用す る こ と ができ る。
    [0101] 担体に固定化する抗原と してほ、 エン ドセリ ン と蛋白 質との複合体を使用する こと ができる。 エン ドセ リ ンと 蛋白質との複合体は、 前述の免疫抗原を調製する方法と 同じ方法によ り調製したものを使用する ことができる。
    [0102] 固相化法は、 固相化抗体と同様に物理的吸着法、 共有 結合法、 架橋法、 包括法のいずれも適用する こ と ができ る。
    [0103] Φ 標識化抗体の調製
    [0104] 標識化抗体の調製は、 使用する標識も し く は標識系に おいて確立された公知の方法を応用する こ と によ リ実施 することができる。 たとえば、 放射性同位元素を標識化 する場合は、 ク ロ ラ ミ ン T法、 ラク トペル才キシダ一ゼ 法、 グルコースォキシダ一ゼ法、 結合法 （B o lt o n - H un t e r法） などを用いる こ と ができる。 酵素を標識化す る場合は、 ダルタルアルデヒ ド法、 過ヨ ウ素酸法、 マ レ イ ミ ド法、 ピリ ジル ' ジスルフイ ド法などを用いる こ と ができる。 また、 抗体に直接酵素を標識化する方法以外 にも ビ才チン標識抗体と酵素標識アビジンを用いる間接 標識法などを用いる こ ともできる。
    [0105] ④ 標識化抗原
    [0106] 標識化抗原の調製は、 標識化抗体と同様に公知の方法 を応用する こと によ り実施する こ と ができる。 たとえば、 放射性同位元素を標識化する場合は、 ク ロ ラ ミ ン τ法、 ラク トペルォキシダ一ゼ法、 グルコースォキシダ一ゼ法 などが適用できる。 また酵素を標識化する場合は、 抗原 と酵素との間にスぺ一サ一を介して間接的に結合させる 方法などを適用する こ と ができる。 該スぺ一サ一と して は、 前述の免疫抗原を調製する時に例示した結合剤を使 用する ことができる。
    [0107] 以上に詳述した固相化抗体、 固相化抗原、 標識化抗体 または標識化抗原の 1 つ以上を用いたエン ドセ リ ンの測 定用試薬キ ジ 卜の具体的構成例をェンザィ ム ノ ア ッ セィ 用キッ 卜の例に基づいてよ リ具体的に説明する。
    [0108] キ ッ ト 〔 A〕 は競合反応法に基づく測定キ ッ トであ り 、 以下の試薬を主要構成要素とする。 ィ、 担体上に固定化した固相化抗原
    [0109] 口、 酵素標識抗エン ドセ リ ンモ ノ ク ローナル抗体 ハ、 エン ドセリ ンの標準溶液
    [0110] 二、 酵素活性測定に必要な基賓溶液
    [0111] 5 ホ、 酵素反応停止溶液
    [0112] キ ッ ト 〔 B〕 はサン ドイ ッチ法に基づく測定キ ッ トで あ り、 以下の試薬を主要構成要素とする。
    [0113] ィ、 担体上に固定化した固相化抗ェン ドセ リ ンモノ ク ロ ーナル抗体
    [0114] 1 0 口、 抗エン ドセ リ ンポリ ク ローナル抗体 （第二抗体溶液） ハ、 ビォチン標識抗 I g G抗体
    [0115] 二、 酵素標識ァビジン
    [0116] ホ、 エン ドセ リ ンの標準溶液
    [0117] へ、 酵素活性測定に必要な基質溶液
    [0118] 1 5 ト、 酵素反応停止溶液
    [0119] 以上の構成要素にさ らに必要に応じて希釈溶液、 呈色 溶液、 洗浄溶液などを追加補充する こ と ができ る。
    [0120] 上記のキ ジ ト 〔 A〕 はたとえば下記の方法によ り使用- する ことができる。
    [0121] Θ 固相化抗原に封してエン ドセ リ ン標準溶液も し く は被 検液と酵素標識抗体を 0〜 4 0 °Cで 0 . 5 〜 5時間反応 させる。 液相と固栢を分離後、 液相および固相のいずれ かの相に基質溶液を加え、 酵素反応させたのち、 酵素反 応を停止させ、 反応液中の光学的強度を測定する。 また、 上記キッ ト 〔 B〕 もたとえば下記の方法によ り 使用する こ と ができる。
    [0122] 固相化抗体とエン ドセ リ ン標準溶液も し く は被検液を 0〜 4 0 ^で 0 . 5〜 5時間反応させる。 担体を洗浄後、 さ らに第二抗体溶液を添加し、 0〜 4 0 で 0 . 5〜 5 時間反応させる。 担体を洗浄後、 ピオチン標識抗 I g G 抗体を加えて反応させ、 次に酵素標識アビジンを加え反 応させる。 液相と固相を分離後、 液相および固相のいず れかの相に基質溶液を加え酵素反応させたのち、 酵素反 応を停止させ、 吸光度を測定する。
    [0123] 次に、 本発明について、 具体的実施例を挙げて説明す る。 なお、 以下の実施例ではエン ドセ リ ンと してヒ ト由 来のものと同一構造を有する合成品を使用 した。
    [0124] 実施例 1 抗エン ドセ リ ン抗血清
    [0125] ① エン ドセ リ ン と ゥシ血清アルブミ ン と の複合体の製 造
    [0126] ゥシ血清アルブミ ン（B S A ) 1 O mgとエン ドセ リ ン 1 〜 2呢を、 0. 1 M りん酸緩衝液（pH 7.0 ) l nuUこ溶解し、 これに 2 1 DiMグルタルアルデヒ ド 〔 0 . 1 M り ん酸緩衝 液（PH 7.0 )に溶解したもの〕 0.5 を撹拌しながら滴 下して室温で 2 4時間反応させた。 反応後、 反応液を
    [0127] 0 . 1 M り ん酸緩衝液（PH 7 . 0 )に対して透析して未反応 物質を除き、 エン ドセリ ンと B S Aとの複合体を得た。
    [0128] 得られた複合体は B S A 1 分子当 り平均 5分子のェン ドセリ ンが結合したものであった。
    [0129] ② 抗エン ドセリ ン抗血清の調製
    [0130] 上記複合体と完全フ ロイン トアジュバン ド と を 1 ： 1 で混合してエマノレジョ ンと し、 これを Balb/cマウス （メ ス、 6週令） に 1 匹当 り 2 5 /igを 3週間おき に 4回腹腔 内投与した。 最終免疫の 1 0 日経過後に採血し、 4 " で 1 6時間放置後 3 0 0 Orpn 1 0分間遠心して得られ た上清を抗エン ドセ リ ン抗血清と した。
    [0131] このよう にして得られた抗ェン ドセリ ン抗血清のェン ドセ リ ンとの反応性を E L I S A法によ り調べた。 すな おち、 B S Aとエン ドセ リ ンとの複合体と同様の反応条 件で調製したエン ドセ リ ン と マ ウ ス血清アルブ ミ ン （ M S A) との複合体または M S Aを 0 . 1 Mりん酸緩衝 生理食塩水 （ P B S ) に 2 Zmfiになるよ う に溶解し、 これを 9 6 ウェルマイ ク 口プレー 卜にウエノレあた り 5 0 を添加し、 4 °Cで 1夜放置して 9 6 ウェルマイ ク ロブ レー 卜にエンドセリ ンと M S Aとの複合体または M S A をコー ト した。
    [0132] コート処理後、 ゥエルを P B Sで 2回洗净し、 3 %ゼ ラチン含有 P B S を各ゥエルに添加して室温で 3 0分間 放置することによ リブロ ッ キング処理を行つ た。
    [0133] ブ Π ッ キング処理後の各ゥエルに上記抗ェン ドセ リ ン 抗血清の希釈液を 5 Ο ίώ加え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 P B Sで 3 回洗浄し、 ピオチン化抗マウス I g G溶液 （ベク ター社製） 5 0 ^加えて室温で 1 時間反応 させた。
    [0134] 次に、 アビジン D—ホースラディ シュぺノレォキシダー ゼ （ベク タ一社製） 溶液 5 を加え、 室温で 3 0分間 反応させた。 P B Sで 3 回洗浄後、 基質溶液 （ 4 —ア ミ ノ アンチピリ ン （ 0. 2 5 m Zmje) 、 フエ ノ ーノレ （ 0 . 2 5 , ιπε / mfi ) 、 0 . 0 0 1 2 5 %過酸化水素含有） 2 ひ を加えて室温にて反応させ、 各ゥエルの 5 5 0 nmにおける吸光度を 9 6 ウェルマイ ク 口プレー ト フ ォ ト メータ一を用いて測定した。
    [0135] 測定した結果を第 1 図に示す。 第 1 図に示すよ う に、 本発明の抗エン ドセ リ ン抗血清は、 エン ドセ リ ンと特異 的に反応し、 検体中のエン ドセ リ ンの測定に使用できる ものであっ た。
    [0136] 実施例 2 抗エン ドセ リ ン抗血清
    [0137] 実施例 1 の①と同様に してエッ グアルブミ ン とエン ド セ リ ンとの複合体を調製した。 得られた複合体はエッ グ アルブミ ン 1分子当 りエン ドセ リ ン 5分子が結合したも のであっ た。
    [0138] この複合体と完全フ ロ イ ン ドアジュバン ト と の 1 ： 1 のェマルジヨ ンを調製し、 ゥサギ 1 匹当 り 0 . 5 mgを 3 週間おきに 2 回免疫した。 最終免疫の 1 0 日後に採血し . 3 0 0 0 rpi 1 0分間遠心し、 上清を抗エン ドセ リ ン抗 血清と した。 このよ う に して得られた抗血清のエン ドセ リ ン との反 応性を実施例 1記載の E L I S A法で測定し、 その結果 を第 2図に示す。 第 2図に示したとおり 、 ゥサギよ り得 られた抗血清はエン ドセ リ ンと特異的に反応するもので あっ た。
    [0139] 実施例 3 抗エン ドセリ ン抗血清
    [0140] 合成ペプチド （NHz -Arg-Cys-His_ Leu- Asp- Ile- Ile- Trp- COQH ) と B S Aとの複合体を実施例 1 と同様に調製 した。 得られた複合体は B S A 1分子当 り合成ペプチ ド 6分子が結合したものであった。
    [0141] この複合体を実施例 1 と同様にマ ウスに免疫し、 得ら れた抗血清とエン ドセ リ ン との反応性を実施例 1記載の E L I S A法で調べた。 その結果を第 3 図に示す。 第 3 図に示したよ う に、 合成ペプチ ドをエン ドセ リ ン抗原と して ^いてエン ドセ リ ンと特異的に反応する抗血清を調 製する こ と ができた。
    [0142] 実施例 抗エン ドセ リ ンモ ノ ク ロ一ナル抗体 ① 抗エン ド 'セ .リ ンモノ ク ローナル抗体の調製
    [0143] 実施例 1 のエン ドセ リ ン一 B S A複合体を生理食塩水 に溶解させたもの （ 1 πιβ Z 1 rnfi ) と完全フ ロ イ ン ドアジ ュノ ン ド と 1 ： 1 で混合してェマルジヨ ン と し、 これを Balb/cマ ウ ス （メ ス、 6週令） の腹腔内に 5 0 g投与し て初回免疫と した。
    [0144] 初回免疫後、 2 ·週間おきに数回、 同様の方法で免疫し た後、 最終免疫と して 5 0 ;¾をマ ウ スの尾静脈に投与 し た。
    [0145] 最終免疫から 3 日後にマ ウ スの脾細胞を摘出 し、 ィ ー ダル最少基本培地 （M E M) で洗浄した。 一方、 マ ウ ス ミ エローマ P 3 X 6 3 8 U . 1 ( P a U！ ) (A T C C C R L — 1 δ 9 7 ) を M E Mで洗浄したもの と上述の 脾細胞と を 1 0 ： 1 で混合し、 遠心分離して得たペ レ ツ ト に 5 0 %ポリエチ レ ングリ コ一ル （ P E G ) 1 0 0 0 含有 M E M溶液 1 ηι を徐々 に加えて、 細胞融合を行っ た。 さ ら に、 M E M溶液を加えて全量を 1 0 mj2と し た後、 遠 心分離 して得たペ レ ッ ト を 1 0 % ゥ シ胎児血清 （ F C S ) 含有 R P M I 1 6 4 0培地に Pa Uiと して 3 X 1 04 cell/ 0 . l m£となる よ う に懸濁させ、 9 6 ウェルマィ ク ロ プレー ト に各ゥエルあた り 0 . l m£ずつ分注 した。 1 日後、 H A T培地を 0 . Ι πιβ添カ卩 し、 その後 3〜4 日 ごと に培地の半分量を新しい H A T培地で交換 し、 ハイ プリ ドーマの生育が認め られたゥエルの上清 1 0 0 s を 分取し、 P B S 2 0 0 Sで希釈 した。 あ ら かじめ M S A でコ ー 卜 した 9 6 ウェルマイ ク 口 プレー 卜およびエン ド セ リ ン一 M S A複合体 （ 1 O gZmfi) でコー ト した 9 6 ウェルマイ ク 口 プレー ト に上記の希釈 し た培養上清液を それぞれ 5 0 ずつ添加 した。 次に ビ才チ ン化ゥマ抗マ ウス I g G抗体 （ベク タ 一社製） を加えた後、 ア ビジン D—酵素結合体と して、 ア ビジン D—ホースラディ ッ シ ュペルォキシダーゼ （ベクター社製） 、 基質および発色 剤と レて過酸化水素および 4一アミ ノアンチピリンー フ エ ノールを用いた E L I S A法によ りエン ドセ リ ン一 M S A複合体と反応し、 M S Aと反応しない抗体を産生す るハイブリ ドーマ 2 1株を選択した。
    [0146] 次に限界希釈法によ リハイブリ ドーマのク ローニング を行つ t。 クノ n—ニング後、 細胞 （ハイプリ ドーマ） を 培養して数を増やし、 あらかじめプリ スタ ンを腹腔内に 投与して 1 ヶ月位たつたマ ウスの腹腔内へ一匹当 り 3 X 1 0 s細胞を投与した。
    [0147] 2週間後マ ウス 1 匹あた り約 2 Ο πώの復水を採取した , 復水約 4 0 mfi ( 2 E分） と同量の P B S を加えて希釈 した後、 飽和硫安 8 0 mfiを加え、 5 0 %硫安飽和条件下 にて沈澱する画分を遠心する こ と によ リ揉琼した。 この 沈澱画分に約 l O mfiの 0 . 1 M ト リ ス -塩酸緩衝液 （pH 7. 2 ) を加えて溶解させ、 これを同緩衝液に封して 2 日間透析した。
    [0148] 次に抗体溶液を D E 5 2 (ワ ッ トマン ¾製） を充填し たカラム （ 2 2諷 X 6 5 cm) に添加し、 素通り画分を集 め、 次にこの素通り画分をウノレ トロゲル A c A 4 4 ( L K B社製） を充填したカ ラム （ 2 2 nm X 6 5 cm) に添加 しゲル瀘過するこ と によ リ、 精製抗体を得た。
    [0149] ② 抗エン ドセ リ ンモノ ク ローナル抗体の免疫学的性質 得られたモノ ク ローナル抗体の特異性を調べるため、 まず、 エン ドセ リ ン一 M S A複合体、 合成ペプチ ド— M S A複合体および M S Aのそれぞれを 9 6 ウェルマイ ク 口 プレー ト に実施例 1 と 同様に コー ト処理およぴブロ ッ ク キング処理を行い、 抗原を固定化 した 9 6 ウェルマィ ク ロ プレー ト を調製した。
    [0150] なお、 合成ペプチ ド と しては実施例 3 と 同 じもの を使 ffliU
    [0151] この合成ペプチ ドは ヒ ト 由来のエン ドセ リ ンの C末端 部の 7残基と 同一のア ミ ノ酸配列をもつ合成ペプチ ドで あ り 、 該合成ペプチ ド と M S Aと の複合体はエン ドセ リ ンー B S A複合体調製と 同様の方法で調製 した。
    [0152] このよ う に して調製 した抗原固定化 9 6 ウェルマイ ク 口 プレー トの各ゥエルに、 各ハイ ブ リ ドーマ榇の培養上 清を 5 0 添加 し、 基質溶液と して 4 ー ァ ミ ノ アンチピ リ ンおよびフエ ノ ーノレの代わ り に〇一フエ 二 レ ンジア ミ ン を使用する以外は実施例 1記載の E L I S A法と 同 の方法.によ り 4 9 2 nmの吸光度を測定 して各ハイ ブ リ ド 一'マ'株産生のモ ノ ク ロ ーナル抗体の特異性を比較検討じ † 。 その結果を第 1表に示す。 なお、 コ ン ト ロ ールと し て、 培養上清の代わ り に 1 % B S A含有 P B S を用 いた 第 1表よ り 明 ら かなよ う にエン ドセ リ ンの c末端部の
    [0153] 7残基に特異性を示すモ ノ ク ロ ーナル抗体 （第 2 、 第 5 . 第 9 、 第 1 3、 第 1 4 、 第 1 6 、 第 1 8〜 2 1 の各ハイ プリ ドーマ株が産生するモ ノ ク □ —ナル抗体） とェン K セ リ ンの C末端部の 7残基以外の部位に特異性を示すモ ノ ク ローナル抗体 （第 1、 第 3、 第 4、 第 6 〜 8、 第 1 0 〜 1 2 、 第 1 5 、 第 1 7 の各ハイ ブリ ドーマ株が産生 するモノ ク ロ ーナル抗体） の 2種類の特異性を有するモ ノ ク ロ一ナル抗体を取得する こ と ができた。
    [0154] ③ 抗エン ドセ リ ンモノ ク ローナル抗体のサブク ラス ド、セリ ン一 M S A複合体 （ 2 / mfi ) を実施例 1 と 様に 9 6—ヴェルマイ ク 口 プレー ト にコー ト処理およ びブロ ッ キング処理を施し、 これに各ハイブリ ドーマ棕 の培養上清を 5 0 ^添加して室温で 1 時間反応させた - 反応後、 ゥサギ抗マウス I gサブク ラス抗 （ザィ メ ッ ド社製） 、 ピオチン化ャギ抗ゥサギ I g G抗体 （べク タ ー社製） 、 ア ビジン D—ホースラディ ッ シュペルォキ 、ンダ一ゼ （ベク タ 一 ¾製） 、 基質溶液 （過酸化水素、 O 一 フ エ二レ ン ジァ ミ ン含有） 、 反応停止液 （ 2 N硫酸） と を厥反応させる E L I S A法によ リ それぞれのハイ ブ リ ドーマの産生するモ ノ ク ローナル抗体のサブク ラスを 調べた。 その結果は第 1表に併せて示した。
    [0155]
    [0156] ④ 抗エン ドセ リ ンモ ノ ク ロ ーナル抗体の中和作用
    [0157] 抗エン ドセ リ ンモ ノ ク ロ ーナル抗体によ るエン ドセ リ ンの中和作用 をイ ン ビボ （in vivo) の系で検討 し た。
    [0158] ウ ィ スタ ーキ ヨ 一 ト ラ ッ ト （W K Y 、 ォス、 8 〜 1 0 週令、 体重 3 0 0〜 3 5 0 g ) の大腿動脈および頸動脈 に力ニューレを揷入した。
    [0159] 薬剤 （アンジォテンシン Π およびエン ドセ リ ン） は無 麻酔および無拘束条件下、 頸動脈に揷入した力ニューレ から注入し、 薬剤の及ぼす血圧及び心拍数に対する作用 を大腿動脈に揷入した力ニューレに接続した圧 トランス デューサ一によ り測定した。 まず、 アンジォテンシン Π 3、 0 0 pmol/ kg、 エン ドセ リ ン 3 0 0 pmol/kgおよびェ ン ドセリ ン 1 nmol kgを注入した時の血圧または心拍数 の変化を第 4 ( a ) 図に示す。
    [0160] 次に、 第 2 0ハイプリ ドーマ株が産生するモノク ロ一 ナル抗体を 8 ing/kg静注後、 5〜 1 0分経過した時点で 上述と同じ薬剤を同量注入した時の血圧および心拍数の 変化を第 4 ( b ) 図に示す。
    [0161] 第 4図よ り明らかなよう に、 本発明の抗エン ドセ リ ン 抗体を投与しない場合にはェン ドセ リ ンによる血圧およ び心拍数の変動が観察される （第 4 ( a ) 図 （ a — 2 ) および （ a — 3 ) ) ものの、 エン ドセ リ ンを投与する前 に抗エン ドセ リ ン抗体を投与した場合にはそのよう な変 動は全く観察されず （第 4 ( b ) 図 （ b — 2 ) および
    [0162] ( b — 3 ) ) 、 本発明の抗エン ドセ リ ンモ ノ ク ローナル 抗体がエン ドセ リ ンの活性を完全に中和 （抑制） してい るこ とが確認された。 また、 第 4図 （ a — 1 ) および ( - 1 ) に示されている よ う に、 アンジォテンシン Π による血圧および心拍数の変動は本発明抗体の投与に関 係な く観察され、 本発明抗体がエン ドセ リ ンを特異的に 中和している こ とも確認された。
    [0163] 実施例 5 エン ドセ リ ンの測定 （競合反応）
    [0164] エン ドセ リ ン一 M S A複合体 （ 0 . 6 ½ZmJ2) を 9 6 ウエノレマイ ク ロプレー トにゥエルあた り 5 0 β添力 [1して、 4 °Cで一夜放置し、 エン ドセ リ ン一 M S A複合体を 9 6 ウェルマィ ク 口プレ一 トにコ一 ト して固相化抗原と した。 実施例 4 で得られたハイプリ ドーマの中から第 1 6、 第 1 7 および第 2 0ハイプリ ドーマ株の培養上清を適宜 1 % B S A含有 P B Sで希釈 （ 3 0〜 3 0 0倍に希釈） したものを抗体溶液と した。
    [0165] ェン ドセ リ ンおよび実施例 3記載の合成ぺプチ ド を用 いてそれぞれ 0〜 2 5 6 0 p Mの濃度範囲になるよ う に 1 % B S A含有 P B Sで段階希釈したものを標準抗原溶 液と した。
    [0166] このよ う に して調整した固相化抗原、 抗体溶液および 標準抗原溶液を用いて、 以下に示す手順で検量線を作成 した。
    [0167] ① 抗体溶液と抗原溶液をそれぞれ 3 0 を混合し、 室 温で 3 0分間反応させる。
    [0168] ② 反応液 5 0 を固相化抗原に添加し、 室温で 1 時
    [0169] 反応させる。
    [0170] ③ P B Sで 2 回洗浄し、 ビォチン化ゥマ抗マ ウス I g G溶液 （ベクタ一社製） を 5 0 ^添加し、 室温で
    [0171] 1時間反応させる。
    [0172] P B S で 2 回洗浄し、 ア ビジン D —ホースラデイ ツ シュペルォキシダーゼ （ベクタ一钍製） 溶液を 5 0 5 添加し、 室温で 1 5分間反応させる。
    [0173] ⑤ P B S で 4回洗浄後、 基質溶液 〔オル ト フ I 二 レン ジ-ァ ミ ン （ 0 · 2 / m£ ) 、 過酸化水素（ 0 . 0 0 5
    [0174] ' 含有 0 . 1 Μクェン酸緩衝液 （ρΗ5 . 0 ) 〕 Ι Ο Ο ίώを加えて発色させ、 2 Ν硫酸溶液 を 10 加えて反応停止後、 4 9 2 rmにおける吸光度を測定す る。
    [0175] このよ う に して作成した検量線を第 5〜 7 図に示す。 第 5〜 7 図よ り明らかなよう に、 上記方法において 4 0 P Mのエン ドセ リ ンを測定する こ と が可能である こ とが
    [0176] I 5 明らかとなっ た。 また第 1 7ハイブリ ドーマ株よ り得ら れた抗体を使 ffiすれば、 ェン ドセ リ ンの C末 7残 ½ の部位も特異的に測定する ことができるため、 エン ドセ ひンの加水分解物をも測定できる ことが示された。 " ' また、 上述の固相化抗原、 抗体溶液、 標準抗原溶液、 0 ピオチン化ゥマ抗マウス I g G溶液、 アビジン D—ホ一 スラディ シュペルォキシダ一ゼ溶液、 基質溶液おょぴ 2 X硫酸溶液 （反応停止液） からなる各試薬を 1 つの小 i に充填し、 エン ドセ リ ン測定用キッ ト と した。
    [0177] 実施例 6 エン ドセ リ ンの測定 （サン ドイ ッチ法） 固相化抗体と しては、 第 1 ハイ プリ ドーマ株の産生す るモ ノ ク ローナル抗体 （ 5 0 /¾ 1^ ) を 9 6 ウェルマィ ク ロ プ レー ト に ゥェゾレあた り 5 添力 Π し、 4 °Cで一夜 放置 してモ ノ ク 口 一ナル抗体を 9 6 ゥェゾレマイ ク ロ プ レ — 卜 にコ ー ト したもの を使用 した。
    [0178] 標準抗原溶液と しては、 エン ドセ リ ン を 0〜 1 2 . 8 (ng/mfi) の濃度範囲になる よ う に 0 . 5 M塩化ナ ト リ ム、 1 0 % B S (ゥシ血清） および 5 % ト ラ ジロール 含有 0 . 1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （pH 8 . 0 ) で段階希 釈 したもの を使用 した。
    [0179] 第二抗体溶液と しては、 第 5ハイ プリ ドーマ株の産生 するモ ノ ク ロ ーナル抗体を常法によ リ ビオチン化し、 1 % B S A含有 0 . 1 M リ ン酸緩衝液 （PH 7 . 0 ) に 2 Z mfiの濃度になる よ う に溶解 したも の を使用 した。
    [0180] 測定は以下の丰順で行っ た。
    [0181] 抗体を コ一 卜 した 9 6 ウェルマイ ク 口 プレー ト に抗 原溶液を ゥエルあた り 5 0 β添加し、 室温で 2時間反 応させる。
    [0182] ② P B Sで洗浄後、 第二抗体溶液を ゥエルあた り 5 0 添加 し、 室温で 1 時間反応させる。
    [0183] ③ P B Sで洗浄後、 ア ビジン D—ホースラディ ッ シ二 ペルォ キシダ一ゼ （ベク タ ー社製） 溶液を ゥエルあた り 5 0； ^添加 し、 室温で 3 0分間反応させる 。
    [0184] ④ P B Sで洗浄後、 基質溶液 〔オル ト フエ 二 レ ンジァ ミ ン （ 0 . 2 mgノ πώ ) 、 過酸化水素水 （ 0 . 0 0 5 % ) 含有 0 . 1 Mクェン酸緩衝液 （ρ Η 5 . 0 ) 〕 をゥエル あたり 1 0 0 ίβ加えて発色させ、 2 Ν硫酸溶液 1 0 0 βを加えて反応を停止後、 4 9 2 nmにおける吸光度を 測定する。
    [0185] このよう に して得られた検量線を第 8 図に示す。 第 8 画 έから明らかなよう に、 本発明抗体をサン ドイ ッチ法に 適用'する ことによ り 0 . 2 ng / mJ2 ( 8 0 P M ) まで測定 する こ とが可能である ことが確認された。
    [0186] また、 上述の固相化抗体、 標準抗原溶液、 第二抗体溶 液、 ア ビジン D —ホースラディ ッ シュペルォキシダ一ゼ 溶液、 基質溶液、 2 N硫酸溶液 （反応停止液） からなる 各試薬を 1つの小箱に充填し、 エン ドセ リ ン測定用キッ ト と した。
    [0187] 産 業 上 の 利 用 可 能 性
    [0188] 本発明の抗体はェン ドセ リ ンと特異的に反応するため、 血中のエン ドセ リ ンを兔疫学的に測定する際に使用する 抗倦と して有用である。 特に抗エン ドセリ ンモ ノ ク ロ一 ナル抗体は、 抗エン ドセリ ン抗血清と比較して以下の特 徴を有しており、 特に有用なものである。
    [0189] ① 抗血清と比較して反応特異性および親和性が限定さ れている。
    [0190] たとえば、 実施例 4で示したモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 ェン ドセリ ンの C末端部も し く は C末端部以外の部位 のいずれかに特異性を示し、 この 2種類のモ ノ ク ロ一 ナル抗体を使用する こ と によ リ エン ドセ リ ン自体はも と よ り 、 エン ドセ リ ンの血中での加水分解フ ラ グメ ン ト をも特異的に測定する こ と ができる。
    [0191] ② 抗血清を比較して、 モ ノ ク ローナル抗体を産生する ハイプリ ドーマを樹立する こ と によ リ 品質の一定した モ ノ ク ローナル抗体を安定に供給する こ と ができる。
    [0192] ③ 競合反応法によ り 4 0 P Mのエン ドセ リ ンを測定す る こ とができ、 きわめて高感度のアツセィ系を組み立 てる こと ができる。 また、 実施例 6で示したよ う に、 特異性の異なる 2種類のモノ ク 口一ナル抗体を使用 し たサン ドイ ッチ法によ り 8 0 p Mのエン ドセ リ ンを測 定する こ とのできるアツセィ系を組み立 7：る こ と がで さる。
    [0193] ④ 本発明の抗エン ドセ リ ンモ ノ ク ローナル抗体を生体 内に投与した場合、 エン ドセ リ ンの作用を中和する こ と ができ （実施例 4 の④参照） 、 医薬と しての可能性 も有している。
    [0194] また、 実施例 3で示すごと く 、 合成ペプチ ドを用いる こ と によ リ エン ドセ リ ン と反応する抗血清およびモ ノ ク ローナル抗体を調製する こ と ができる。 このこ と は、 抗 原と して使用するエン ドセ リ ン分子全体を化学的に合成 する時間と手間を大幅に短縮する こ と ができるものであ る。
    特許協力条約に基づいて公開された国際出願
    (51)国際特許分類 4
    (Π)国際公開番号
    G01N 33/53, 33/577
    A1
    (43)国際公開日 1989年 11月 16日（16.11.89)
    (21) 国際出願番号 PCT/JP89/O0455 颗鶴 ( URIHARA, Hi roki )C JP TP]
    (22) 国際出願日 1989年 5月 1曰 （ 01. 05. 89 ) 〒136 東京都江東区亀戸 3丁目 3番 6号
    (30) 優先権.データ 亀戸天輸 カイ 904 Tokyo, (JP)
    198 5月 7曰 （ 07. 05. 88) 浜沖 勝 (HA 1AO I, Masaru)C JP/JP]
    麵昭 63 - 131086 1988^5月 28曰 （28. 05. 88) 加藤裕久 ( ATO, Hirohi sa)CJP//JPD
    〒288 千 »；铫子市栄町 2丁目 2番地 ©2
    Chiba, (JP)
    (71) 出願人（米国を除くすべての指定国につ て） (81) 指定国
    ャマサ »« AT (欧州特許）， AU， B E ( i ^ ) , CH( f¾¾ ^特許），
    (YAMA.SA SHOYU KABUSHIKI KAISHA) C JH JP] DE(i^H特許）， FR(i¾N特許）， GB (欧州特許）， IT(WH特許） 〒288 千纖鮮市新生町 2丁目 10番地の 1 Ciiiba， ( JP) JP， KR, LU (欧州特許）， NL Cl^i^特許）， SE ( i^H^), US
    (72) 発明者；および 添付公開書類 国際調査報告甞
    (75) 発明者/出願人（米国についてのみ）
    木 (KIMURA, Sadao)C JP/JPD
    〒305 茨城県つくば市竹園 1丁目 8 - 1 907楝 30 3号
    Ibaraki , (JP)
    柳'証史 CYANAGISAWA, Ma sa s h i )C
    T305 茨城県つくば市並木 2丁目; I 867番地 207楝 105号
    Ibaraki , (JP)
    矢崎義雄 (YAZA I， Yo sh i o)C JP/JP 3
    T112 東京都 区小日向 3丁目 12番 4号 okyo, (JP)
    (54) Title: ANTI-ENDOTHELIN ANTIBODY
    (54)発明の名称 抗 ヱ ン ド セ リ ン 抗 体 ( — ノ ia-2) (a-3)
    ·/じ'断4'
    (Λ H) '0。
    "/
    (57) Abstract
    An antibody speciiically reacting with endothelin， a process for its preparation, an immunological assay of endoserine using said antibody as an antibody reagent, and a kit for the assay are disclosed.
    PCTガゼッ ト番号 Νο·04/1990セクショ ン
    权利要求:
    Claims 求 の 範 囲
    1 . エン ドセ リ ンに対して特異的に反応する抗体。
    2 . 抗体がポリ ク ローナル抗体である請求の範囲第 1項 記載の抗体。
    3 . 抗体がモノ ク ローナル抗体である請求の範囲第 1項 記載の抗体。 .
    4： ェ-ン ドセ リ ンがヒ トまたはブタ 由来のものである請 求の範囲第 1〜 3項いずれかに記载の抗体。
    5 . エン ドセ リ ンに対して特異的に反応する抗体を主成 分と して含有する抗血清。
    6 . エン ドセリ ンがヒ トまたはブタ 由来のものである請 求の範囲第 5項に記载の抗血清。
    7 . 式 〔 I 〕 ' ulu-Lys-ASp- et-Leu-^er-Ser-Cys-Ser-Cys-H
    Cy s '
    Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH
    C I ] 〔式中、 Cysは L一システィ ン、 Serは L ーセ リ ン、 Leu は L一 口イ シン、 Metは L一メチォニン、 Aspは L ーァ スパラギン酸、 Ly sは L一リ ジン、 Gluは L ー グノレタ ミ ン酸、 Valは Lーノ リ ン、 Tyrは Lーチロ シン、 Pheは L一フエ二ルァラニン、 Hisは L—ヒ スチジン、 lieは L一イ ソ ロイシン、 Trpは L一 ト リ プ ト フ ァ ンを示す。 〕 で表おされるエン ドセ リ ンに対して特異的に反応す る抗体。
    8 . 抗体がポリ ク ロ ーナル抗体である請求の範囲第 7項 記載の抗体。
    9 . 抗体がモ ノ ク ローナル抗体である請求の範囲第 7項 記載の抗体。
    1 0 . エ ン ドセ リ ン に特異的に反応する抗体の製造法であ つて、 エン ドセ リ ンを担体に結合せしめた複合体を免 疫抗原と して使用する こ と を特徴とするェ ン ドセ リ ン に対して特異的に反応する抗体の製造法。
    1 1 . 検体中のエン ドセ リ ンを免疫学的に測定するための 方法であって、 抗体試薬と してエ ン ドセ リ ン に特異的 に反応する抗体を使用する こ と を特徴とするェ ン ドセ リ ン の免疫学的測定法。
    1 2 . 抗体がポリ ク 口 一ナル抗体である請求の範囲第 1 4 項記載の免疫学的測定法。
    13 . 抗体がモ ノ ク ロ ーナル抗体である請求の範囲第 1 4 項記載の免疫学的測定法。
    4。 ェン ドセ リ ンに対して特異的に反応する抗体を主要 構成要素と して含有してなるェ ン ドセ リ ン測定用キッ 卜。
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    同族专利:
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    AU3540389A|1989-11-29|
    AU634158B2|1993-02-18|
    EP0423333A1|1991-04-24|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-11-16| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1989-11-16| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU JP KR US |
    1990-02-08| CFP| Corrected version of a pamphlet front page|
    1990-02-08| CR1| Correction of entry in section i|Free format text: IN PAT.BUL.27/89,UNDER INID (54) TITLE AND (57) ABSTRACT EACH TIME THE WORD"ENDOSERINE"IS MENTIONED,IT SHOULD BE REPLACED BY THE WORD"ENDOTHELIN" |
    1990-11-07| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989905185 Country of ref document: EP |
    1991-04-24| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989905185 Country of ref document: EP |
    1994-05-25| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1989905185 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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